11. Aislamiento y cultivo de hongos

PRÁCTICA No. 11 

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE HONGOS

  
I.- OBJETIVO. Aplicar las técnicas para aislar, cultivar y observar la morfología colonial y microscópica de hongos  filamentosos y levaduras. 

II.- INTRODUCCIÓN. Los hongos incluyen los mohos y levaduras y como grupo  difiere de los protozoos en virtud de su pared celular rígida, producción de esporas, carencia de movilidad y posición filogenética.

     Los hongos filamentosos están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se ven frecuentemente sobre pan viejo, queso o frutas. Cada filamento crece fundamentalmente en el extremo por un mecanismo de extensión celular.

Bajo esta denominación se incluye un amplio grupo de organismos de gran heterogeneidad. Entre las características comunes a todos los hongos pueden destacarse dos: 

a) Estar formados por una o más células eucariotas.

b) Carecen de clorofila u otro pigmento fotosintético.

      Los hongos son organismos heterótrofos que necesitan para su nutrición sustancias orgánicas ya elaboradas; la mayoría son saprófitos  - se desarrollan sobre materia orgánica en descomposición - algunos son parásitos que producen enfermedades en el hombre, animales, vegetales y otros tienen importancia industrial.

     Dentro de los hongos podemos encontrar las levaduras que generalmente son unicelulares  y los filamentosos (mohos) o pluricelulares, estos tienen una estructura denominada "talo" y  suele estar constituida por una serie de filamentos denominados "hifas", que pueden ser ramificadas y tabicadas, formando, en su conjunto, una estructura denominada "micelio".

   Su reproducción puede ser sexual o asexual (gemación, esporulación, fragmentación) y su clasificación es compleja y se puede realizar atendiendo a diferentes caracteres.

III.- CORRELACIÓN CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA (ING. BIOQUÍMICA BQO-0525). 

Tema: Microorganismos eucariotas.

Subtema: Hongos pluricelulares y unicelulares.

Se deben conocer las técnicas para aislar y cultivar hongos y levaduras ya que esto nos permite su estudio y uso en otros proceso relacionados con la industria, genética etc.

IV.- MATERIAL Y EQUIPO  

·         Matraz con 150 mL de agar papa dextrosa (PDA)
·         Tubo con 5 mL de ácido tartárico al 10%
·         2 cajas para microcultivo
·         Tubo con 8 mL de glicerol al 10%
·         5 cajas Petri
·          2 porta objetos
·         2 cubre objetos
·         5 tubos con 9 mL de agua destilada
·         Muestra de suelo o alimento
·         2 pipetas de 1 ó 2 mL
·         Colorante azul de metileno diluido
·         Espátula
·         2 cajas con 20 mL de PDA
·         2 cajas con PDA
·         2 cajas con agar extracto de malta
·         Microscopio estereoscópico
·         Microscopio óptico

 

V.- PROCEDIMIENTO 

Aislamiento de hongos  por diluciones en serie
Primera sesión
Preparación de las diluciones

1.    Tomar una serie de 5 tubos con 9 mL de agua destilada, previamente esterilizados.
2.    Rotular cada uno de los tubos con la dilución correspondiente   (10^-1 hasta 10^-5).
3.    Comenzar a partir de una muestra de suelo o un alimento (p.e. fruta) que presente algún crecimiento de hongo.
4.    Manteniendo las condiciones de esterilidad y asepsia correspondientes, colocar 1 gr de la muestra  en el primero de los 5 tubos de dilución  (10^-1).
5.    Agitar bien el tubo 10^-1, dejar sedimentar las partículas grandes y con una pipeta estéril, transferir 1 mL  al segundo tubo (10^-2)
6.    Agitar las mismas veces que el primer tubo y continuar hasta completar la serie de diluciones.

Siembra por vaciado en caja    

1.    Rotular cada una de las cajas por duplicado,  con la dilución correspondiente.
2.    Con otra pipeta estéril tomar 1ml comenzando con la dilución 10^-5 y vaciar a la caja correspondiente, hasta llegar a 10^-1.
3.    Fundir el agar papa dextrosa previamente preparado.
4.    Una vez enfriado a 45°C, acidificar el medio con ácido Tartárico (leer la etiqueta de preparación del medio de cultivo).
5.    Proceder el vaciado del agar en cada una de las cajas.
6.    Homogeneizar con movimientos suaves.
7.    Una vez solidificado el medio, incubar a 28°C por 5  a 7 días una serie de cajas y la otra incubarla a 35°C por 48 horas.
8.    Revisar las cajas cada 24 horas y a las 48 realizar el conteo de levaduras. 

Segunda sesión
Conteo de colonias  

1.    Contar las UFC de levaduras/g de muestra
2.    Seleccionar una colonia aislada,  sospechosa de ser levadura.
3.    Sembrarla por estría cruzada en una caja de PDA y en agar extracto de malta.
4.    Incubarla a 35 ⁰C por 48 horas. (Esta caja se utilizará en la práctica de  levaduras).
5.    Contar  las UFC de hongos/ g de muestra.
6.    Seleccionar una colonia que se encuentre perfectamente aislada.
7.    Realizar la morfología colonial del hongo y observar con el microscópio estereoscópico.
8.    Anotar los resultados.
9.    Esta misma colonia se utilizará para realizar el microcultivo.

 

 Microcultivo 

1.    Utilizar la caja de PDA con 20 mL de medio, con un bisturí (esterilizado con alcohol) cortar cuadros en el agar de aproximadamente 1.5 cm².
2.    Colocar un cuadro del agar sobre el cubreobjetos de la caja de microcultivo.
3.    Con un asa estéril doblada en ángulo de 90° raspar un poco de micelio de la colonia del hongo seleccionado y proceder a inocular el cuadro de agar en los cuatro lados respectivamente, esterilizando el asa y tomando más micelio en cada ocasión.
4.    Utilizando unas pinzas, poner el cubreobjetos de la caja de microcultivo  sobre el trozo de agar presionando suavemente.
5.    Adicionar en el fondo de la caja del microcultivo el glicerol al 10 % (tener cuidado de no depositarlo sobre el cuadro de agar).
6.    Colocar la tapa y rotular.
7.     Incubar a 28°C durante 48 a 72 horas.

Observación del microcultivo
Tercera sesión 

1.    En un portaobjetos limpio, adicionar  una gota de colorante azul de metileno diluido.
2.    Colocarle el cubreobjetos con el crecimiento adherido del hongo.
3.    Con una pinzas o bisturí estéril retirar el trozo agar que esta sobre el portaobjetos colocándolo en un lado de la caja.
4.    Al  portaobjetos del microcultivo adicionarle una gota del mismo colorante y colocarle un cubreobjetos limpio.
5.    Sellar las preparaciones con barniz de uñas.
6.    Observar con el objetivo de seco fuerte.
7.    Hacer dibujos de sus observaciones.
8.    Buscar en la bibliografía e identificar el hongo aislado. 

VI.- SUGERENCIAS DIDÁCTICAS 

1.    Fomentar la investigación a través de las preparaciones observadas.
2.    Propiciar una discusión de resultados y comparar las diferencias que existen con otros grupos microbianos en cuanto a su cultivo, observación macroscópica y microscópica.

VII.- REPORTE:

1. Indicar el UFC de hongos/g de muestra.

Dilución	UFC/g de muestra

2.- Indicar el UFC de levaduras/g de muestra

Dilución	UFC/g de muestra

3.-Completar las siguientes tablas de resultados.

 

Morfología microscópica
Color del micelio
Tipo de micelio
Esporas sexuales
Esporas asexuales

 

 

4. Hacer diagramas de las esporas de hongos observadas e identificadas.

CUESTIONARIO     

1.     Explicar por que en el caso del aislamiento de hongos se efectúan menos diluciones que con respecto a las bacterias.
2.    Diga  que utilidad tienen los microcultivos.
3.    Investigar los componentes de los medios de cultivo utilizados y mencione otros dos medios de cultivo para hongos, sus componentes y su uso.
4.    Explicar por que las levaduras pertenecen al reino de los hongos.
5.     Mencionar las diferencias con otros grupos microbianos por ejemplo las bacterias. 

VIII.- BIBLIOGRAFÍA

1.     Frazier W. C. y D. C. Westhoff. 2003. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza España.
2.    Ingold C.T., H.J. Hudson. The Biology of Fungi. 6^th  Ed. Chapman and Hall. Madigan, M.T., J.M. Martiniko y J. Parker.2003 Brock: Biología de los microorganismos. Madrid, España. 10^a  edición. Editorial Pearson Prentice-Hall.