6. Morfología Microscópica, Tinciones Diferenciales y Selectivas

PRÁCTICA No. 6
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA,  TINCIONES
DIFERENCIALES Y SELECTIVAS

  

I.- OBJETIVO.  Aplicar una técnica de tinción diferencial; la tinción de Gram y conocer la morfología microscópica de las bacterias así como su desarrollo en medios líquidos. 

II.- INTRODUCCIÓN.  La forma de las bacterias depende de varias características, algunas de ellas son:

• Estado fisiológico del microorganismo.
  
• Temperatura
  
• Fase de su ciclo de vida
  
• Presencia de anticuerpos 

Las características que podemos observar en un frotis y que distinguen a unas bacterias de otras son:

• Forma
• Tamaño
  
• Agrupación
  
• Color o tinción
  
• Presencia de esporas
  
• Flexibilidad o rigidez 

Las formas o tipos morfológicos que presentan las células bacterianas son:

• Esféricas
• Cíclicas
• Helicoidales
• Planas 

El tamaño se da en micras y es variado, existen bacterias como Escherichia coli  cuyas medidas son 0.5 µ de ancho por 2 µ de largo, Staphylococcus aureus que mide de 8 a 1 µ de diámetro, Beggiatoa mide 26-55 µ de ancho por 5 a 13 µ de largo, entre otras bacterias. 

La agrupación va a depender de cómo la bacteria se multiplica ya que algunos microorganismos tienen la tendencia a permanecer juntos dando una agrupación características, y otros pueden separarse. Por lo tanto las bacterias pueden quedarse solas o agruparse en pares, cadenas, racimos, tetradas, en paquetes cúbicos, etc.

Es importante observar también la presencia de esporas, quistes, esporangiosporas, conidisporas, etc. u otras estructuras como vainas, flagelos, etc. La mayoría de las células utilizadas en el laboratorio son rígidas, pero hay otras que son flexibles como los vibrios y espirilas. 

Una de las técnicas de tinción mas importantes en microbiología y mas ampliamente utilizada, es la  de Gram llamada así en honor a su inventor Chistian Gram, un bacteriólogo danés quien descubrió en 1883 esta técnica diferencial, la cual divide a las bacterias en dos grupos en base a la composición química de su pared celular. Las Gram positivas retienen el colorante primario (cristal violeta) y las Gram negativas, retienen el colorante secundario (safranina) .

     Es preciso añadir aquí que la coloración de Gram de muchas especies es variable, además, no todas las bacterias Gram positivas retiene el colorante primario con la misma intensidad. Por otra parte es muy importante tener en cuenta el tiempo de decoloración ya que si se decolora demasiado todas las células, dejaran escapar el colorante primario y aparecerán como Gram negativas.

La edad del cultivo, determina los resultados finales de la tinción de Gram ya que al envejecer, las células tienden a volverse Gram negativas, incluso la que eran Gram positiva. Por lo tanto es  importante recordar  que la tinción de Gram únicamente da resultados validos cuando se aplica a cultivos nuevos, de 24 horas o menos. 

III.- CORRELACIÓN CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA (ING. BIOQUÍMICA BQO-0525). 

Tema: Métodos y técnicas microbiológicas básicas.

Subtema: Criterios utilizados en la identificación de microorganismos.

Tema: Microorganismos procariotas.

 

Subtema: Morfología y estructura bacteriana. Reproducción bacteriana.

Para la  identificación de un microorganismo es importante iniciar determinando sus características macroscópicas como lo es la morfología colonial, posteriormente su morfología microscópica y tinción, después las características bioquímicas,  químicas, de patogenicidad, etc. que nos ayudan en su clasificación.

FORMA Y DISPOSICIÓN DE LAS BACTERIAS

IV.- MATERIAL Y EQUIPO 

• 3 cultivos bacterianos
• 3 portaobjetos
• Asa bacteriológica
• Mechero
• Microscopio
• 6 portaobjetos
• 1 asa bacteriológica
• 1 mechero Bunsen.
• 1 microscopio
• Colorante cristal violeta
• Solución de yodo de Gram.
• Solución decolorante (alcohol-acetona)
• Safranina de Gram.
• Cultivo de 24 h. de cada una de las colonias aisladas de la práctica No. 3.
• Colorante verde de malaquita.
• Puente de tinción metálico.

 

V.- PROCEDIMIENTO 

Desarrollo en cultivos líquidos:

1. En los cultivos inoculados en medio liquido, determinar el tipo de desarrollo presentado en cada uno de ellos.
2. Anotar sus resultados en una tabla.

PREPARACION DE FROTIS:

Frotis de un  medio sólido 

1. Con un asa estéril colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos.
2. Esterilizar el asa y tomar un poco de la colonia bacteriana, homogeneizarla con el agua, extendiéndolo en un cuadro de 1cm por lado, formando una película delgada.

     3. Dejar secar al aire.
     4. Enseguida fijar con calor, siguiendo las instrucciones del profesor.

 Frotis de un medio liquido 

1. Con un asa estéril, tomar una asada del cultivo líquido y colocarlo en el centro del portaobjeto.
2. Dejarlo secar al aire.
3. Repetir los pasos 1 y 2, por lo menos 4 o 5 veces colocando una gota sobre la otra.
4. Fijar con calor. 

Tinción diferencial: Tinción de Gram

1. Utilizar los frotis de sus cultivos puros.
2. Teñir mediante la técnica de Gram que consiste en los siguientes pasos:

      a) Adicionar Cristal violeta sobre el frotis, dejarlo actuar 1 min. Y lavar.
      b) Adicionar Lugol, dejarlo actuar 1 min. Y lavar.
      c) Decolorar con Alcohol acetona de acuerdo a las instrucciones del profesor y lavar.
      d) Adicionar Safranina, dejarla actuar 30 seg, y lavar.
      e) Lavar con Agua después de cada paso.
      f) Dejar secar al aire y observar.
      g) Los microorganismos Gram positivos se observan de color morado y los Gram negativos de
          color rojo. 

Tinción selectiva: Tinción de esporas.

1. Utilizar un frotis hecho a partir de medio sólido.
2. Teñir mediante la técnica de Sheaffer y Fulton que consiste en los siguientes pasos:

      a) Cubrir el frotis con verde de malaquita y dejarlo actuar durante 1 min.
      b) Calentar la preparación a emisión de vapores durante 5 min. EL COLORANTE NO DEBE
           HERVIR NI SECARSE.
      c) Lavar la preparación con agua de la llave.
      d) Cubrir la preparación con safranina y dejarla actuar 1 min.
      e) Lavar la preparación.
      f) Dejar secar al aire y observar.
      g) Las esporas se observan de color verde y el microorganismo de color rojo.
 

VI.- SUGERENCIAS DIDÁCTICAS 

1. Fomentar la investigación a través de observar la morfología microscópica de su cultivo puro.
2. Generar una discusión de los resultados obtenidos con sus cultivos puros, respecto a la morfología colonial y microscópica. 

VII.- REPORTE 

1. Anotar en una tabla el tipo de crecimiento que presentó cada colonia en el medio líquido.
2. Investigar  como esta formado un colorante y diga cuantos tipos de tinciones existen.
3. Explicar  porque la decoloración es un paso muy importante en la tinción de Gram.
4. Investigar por que los microorganismos Gram positivos se observan de un color y los Gram negativos de otro color.
5. Escriba correctamente el nombre de 3 microorganismos Gram positivos y 3 Gram negativos.
6. Mencione otras dos tinciones selectivas.
7. Describa los pasos para realizar alguna de ellas. 

VIII.- BIBLIOGRAFÍA  

1. Madigan, M. T., J.M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock Biología de los microorganismos. Madrid, España. 10^a  edición. Editorial Pearson-Prentice-Hall.
2. Prescott, L.M. Harley, J.P. y Klein, D.A. 2004. Microbiología. Madrid, España. 5^a  edición. Mc Graw-Hill Interamericana.