9. Identificación Bioquímica de Enterobacterias

PRÁCTICA No. 9 

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTERIAS 

I.- OBJETIVO. Identificar una enterobacteria utilizando un sistema de pruebas bioquímicas  de BBL Crystal E / NF ID System. 

Aplicará el sistema de pruebas bioquímicas BBL – crystal para la identificación de patógenos entéricos /no fermentables (enterobacterias).  

II.- INTRODUCCIÓN. Este es un método de identificación que requiere de cantidades muy pequeñas de  diferentes medios , se basa en la utilización y degradación de sustratos específicos por parte de los microorganismos siendo detectados por distintos sistemas indicadores .Muchas de las pruebas utilizadas  son modificaciones de los métodos clásicos.

            Las reacciones de fermentación detectan la capacidad de un aislado para metabolizar los carbohidratos en ausencia de oxigeno atmosférico, las reacciones de oxidación están basadas en la capacidad de un organismos para metabolizar el sustrato siendo el oxigeno el aceptor final de electrones.

            Ambas reacciones se detectan normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el sustrato de análisis. Los sustratos cromógenos al sufrir hidrólisis producen cambios de color que pueden ser detectados visualmente. Además existen otros análisis que detectan la capacidad de un organismo para hidrolizar, degradar, reducir o utilizar de otro modo un sustrato en el sistema de BBL – crystal.

The BBL Crystal E/NF ID kit is comprised of (i) BBL Crystal E/NF panel lids, (ii) BBL Crystal bases and (iii) BBL Crystal™ Enteric/Stool ID Inoculum Fluid (IF) tubes.               El Kit de BBL Crystal E / NF ID está compuesto de un panel de sustratos en la tapa, una base y un tubo con líquido de inoculación. The lid contains 30 dehydrated substrates on tips of plastic prongs. La tapa contiene 30 sustratos deshidratados en determinadas series y secuencias. The base has 30 reaction wells. La base tiene 30 pozos para la reacción. Test inoculum is prepared with the inoculum fluid and is used to fill all 30 wells in the base. La muestra para el inoculo se prepara con el líquido de inoculación y se usa para llenar los 30 pozos en la base. When the lid is aligned with the base and snapped in place, the test inoculum rehydrates the dried substrates and initiates test reactions. Cuando la tapa está alineada con la base y se asentó en el lugar, la prueba de inoculo rehidrata los sustratos secos e inicia las reacciones ensayo.

Following an incubation period, the wells are examined for color changes.               Después de un período de incubación, los pozos son examinados por los cambios de color. Color changes result from metabolic activities of the microorganisms. El cambio de color se debe a la actividad metabólica del microorganismo en presencia de dicho sustrato. The resulting pattern of the 30 reactions is converted into a ten digit profile number that is used as the basis for identification. ⁶ Biochemical and enzymatic reaction patterns for the 30 BBL Crystal E/NF ID substrates with a wide variety of microorganisms are stored in the BBL Crystal E/NF ID database. Con el patrón resultante de las 30 reacciones se obtiene una serie de diez dígitos clave que es el  número de perfil que se utiliza como base para la identificación. De acuerdo a los 30 patrones de sustratos se generan reacciones bioquímicas y enzimáticas de una gran variedad de microorganismos almacenados en la base de datos de BBL Crystal E / NF ID. Identification is derived from a comparative analysis of the reaction pattern of the test isolate to those held in the database. La identificación se deriva de un análisis comparativo de la reacción patrón obtenida con la información que se encuentra en la base de datos.
 

III.- CORRELACIÓN CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA (ING. BIOQUÍMICA BQO-0525). 

Tema: Métodos y técnicas microbiolológicas básicas.

Subtema: Criterios utilizados en la identificación de microorganismos.

Las enterobacterias constituyen un grupo microbiano importante, ya que entre ellas se encuentran algunos patógenos por lo que es necesario conocer los diferentes métodos que existen para clasificarlas e identificarlas.
 

The BBL Crystal E/NF ID kit is comprised of (i) BBL Crystal E/NF panel lids, (ii) BBL Crystal bases and (iii) BBL Crystal™ Enteric/Stool ID Inoculum Fluid (IF) tubes.  The lid contains 30 dehydrated substrates on tips of plastic prongsIV.-The base has 30 reaction wellsIV>_Test inoculum is prepared with the inoculum fluid and is used to fill all 30 wells in the base. When the lid is aligned with the base and snapped in place, the test inoculum rehydrates the dried substrates and initMATERIAL Y EQUIPO 

• Cultivo microbiano de 18 a 24 h. de un microorganismo Gram negativo
• Kit de BBL Crystal
• Computadora con el software para leer el BBL Crystal.
• Tiras de papel filtro
• Reactivo para oxidasa
• Reactivo para indol
• Incubadora 

V.- PROCEDIMIENTO

      1.  Realizar una tinción diferencial para confirmar la identificación gram de la colonia.
2. Confirmando que la bacteria es gram negativa, utilizar el Kit de BBL Crystal Enteric/ Nonfermenter ID System.
3.    En condiciones asépticas y estériles, tomar una asada del cultivo del microorganismo  y resuspender en el líquido de inoculación que provee el kit hasta que se observe turbio.
4.    Verter el contenido en la base de color negro del Kit.
5.    Distribuir por todo el canal con el fin de llenar todos los pocillos.
6.    Regresar el exceso de inóculo concentrarlo a un costado de la base.
7.    Abrir el empaque que contiene los 30 pozos con los diferentes medios de  cultivo para la reacción y colocarlo sobre la base, alinear hasta que haga “clik”.
8.    Colocarlo sobre la base blanca a la cual se le pone un pedazo de algodón húmedo  para evitar la desecación.
9.    Incubar por 24 Hrs., a 35°C.
 

Prueba de Indol y Oxidasa

      1. Tomar dos tiras de papel filtro.
2.    Manteniendo condiciones apropiadas de asepsia y esterilidad, con un asa tomar inóculo del crecimiento en el tubo de agar inclinado.
3.    Colocarlo sobre un extremo de ambas tiras de papel.
4.    Tomar el reactivo de Indol  y presionar fuerte para romper la ampolleta de vidrio que se encuentra en el interior y dejar libre el contenido.
5.    Colocar una gota sobre el extremo de la tira impregnado con el microorganismo, si vira a color verde, indica prueba (+).
6.    En la segunda tira, realizar el mismo procedimiento utilizando la ampolleta de oxidasa; un vire a color a morado, indica prueba (+).
7.    Anotar resultados.
 

Lectura de resultados

1. Utilizar la computadora o una tabla con el patrón del vire de los indicadores de los medios utilizados.
2. Anotar en la tabla de resultados proporcionada con el sistema BBl- crystal, si este es (+) o (-) de acuerdo al color que presente.
3. Sumar los puntos obtenidos con los resultados positivos. NOTA: ver ejemplo
4. Obtener una serie de 10 dígitos.
5.  Introducir la serie obtenida en la base de datos para BBL Crystal E/ NF ID en el equipo de cómputo.
   
6. Ver los datos estadísticos.