16. Transformación Bacteriana

PRÁCTICA No.16
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA 

I.- OBJETIVO: Realizar una transformación bacteriana, utilizando un plásmido de fluorescencia. 

II.- INTRODUCCIÓN: La transformación genética, implica la inserción de ADN nuevo en la célula. Además del ADN que existe en el cromosoma, las bacterias frecuentemente contienen una o más piezas pequeñas de ADN circular, llamadas plásmidos.

Mediante  la Ingeniería Genética, se pueden insertar en un plásmido, genes que codifican diferentes características, las cuales se ponen de manifiesto al hacer crecer al microorganismo transformado con el plásmido.

La transformación genética se utiliza en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura se han transformado plantas para resistir congelamiento, descomposición y plagas. En biorremediación se puede lograr que las bacterias degraden los derrames de aceites en los mares. En medicina muchas enfermedades causadas por defectos genéticos se han empezado a tratar mediante terapia génica, transformando  las células de las personas enfermas con copias sanas del gen defectuoso que causa la enfermedad.

Los mejores candidatos para la transformación, son las bacterias, por ser organismos unicelulares de rápida reproducción. El organismo no debe producir toxinas o compuestos dañinos.

Uno de los microorganismos más utilizados es Escherichia coli , en esta práctica será transformada con un gen que codifica la resistencia a ampicilina y la    producción de una  proteína fluorescente GFP cuya fuente es una medusa bioluminiscente Aequorea victor, que nos permitirá observar las colonias bacterianas con fluorescencia al colocarlas bajo una lámpara de luz ultra violeta .

III.- CORRELACIÓN CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA (ING. BIOQUÍMICA BQO-0525).

Tema: Genética microbiana

Subtema: Variabilidad genética en microorganismos. Transformación bacteriana.

La transformación bacteriana permite que los microorganismos adquieran nuevas características  genotípicas y que estas puedan ser expresadas.

IV.- MATERIAL Y EQUIPO 

• Kit Biotechnology Explorer para transformación bacteriana pGLO^TM de BIO-RAD.Catálogo # 166-0003EDU
• Caja Petri con Escherichia coli
• 1 caja Petri con medio LB
• 2 cajas Petri con medio LB/amp
• 1 caja Petri con medio LB/amp/ara
• Solución de transformación
• Caldo LB
• Asa bacteriológica
• 5 pipetas
• Gradilla de foam
• Recipiente con hielo frapé
• Frasco con el plásmido hidratado
• Baño de agua con termómetro a 42 ^oC.
• Incubadora a 37 ^oC.

V.- PROCEDIMIENTO
Primera etapa (3 a 7 días antes de la práctica).

Preparación de agar LB.

1. En un matraz de 1 L, agregar 500 mL de agua destilada y adicionarle el sobre con el medio de cultivo.
2. Mezclar y calentar a ebullición, hasta disolver el agar o utilizar el horno de microondas.
3. Mantener a 50 ^oC, hasta adicionarle el azúcar y el antibiótico.

Preparación de arabinosa y ampicilina

Arabinosa

1. Con una pipeta estéril agregar 3 mL de solución transformante al frasco con el azúcar.
2. Tapar y mezclar (requiere de 10 min para disolverse).

Ampicilina

1. Con otra pipeta estéril, agregar 3 mL de solución transformante al frasco con el antibiótico.
2. Tapar y mezclar. 

Etiquetado de placas

1.   Marcar las cajas de la siguiente manera:
16 cajas con LB
16 cajas con LB/amp.
8 cajas con LB/amp/ara 

Preparación y vaciado de cajas

1. Vaciar las 16 cajas marcadas con agar LB
2. Dejar solidificar las cajas.
3. Agregar  toda la ampicilina hidratada al medio de cultivo restante y homogenizar.
4. Vaciar las 16 cajas marcadas con agar LB/amp
5. Dejar solidificar las cajas
6. Agregar la arabinosa al medio restante en el matraz y homogenizar.
7. Vaciar las 8 cajas marcadas con LB/amp/ara.
8. Dejar solidificar las cajas.
9. Todas las cajas ya solidificadas, sin invertir ni en bolsas de plástico, deben permanecer a temperatura ambiente durante dos días.
10. Invertir las cajas y guardarlas en bolsa de plástico en el refrigerador , hasta su uso.

Segunda Etapa 
Rehidratación de la bacteria (24 a 36 horas antes de la práctica)

1. Con una pipeta estéril, rehidratar la cepa liofilizada de Escherichia coli HB 101, adicionando 250 µL de la solución de transformación en el frasco.
2. Tapar y dejarlo a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Mezclar.
4. Sembrar por estría cruzada, una placa de agar LB, para cada equipo de trabajo (máximo 8 ).
5. Incubar a 37 ^oC durante 24 a 36 horas.

Preparación del plásmido pGLO

1. Con pipeta estéril agregar 250 µL de solución transformante al frasco que contiene el plásmido.
2. Guardarlo en el refrigerador.

Preparación de las soluciones de trabajo

1. Preparar un microtubo de color, con 1 mL de solución de transformación, para cada equipo de trabajo.
2. Marcarlos como ST y poner el número del equipo.
3. Preparar un microtubo  de otro color, con 1 mL de caldo nutritivo LB, para cada equipo de trabajo.
4. Marcarlos como LB y poner el número del equipo.
5. Si se preparan un día antes de la práctica, conservar en refrigeración.

Tercera Etapa 

Transformación  Bacteriana.

1. Marcar 2 microtubos, uno como ADN+ y el otro como ADN-.Anotar el número del equipo.
2. Colocarlos en la gradilla de foam.
3. Con pipeta estéril, adicionar a cada tubo 250 µL de solución de transformación.
4. Colocar la gradilla con los tubos en el hielo.
5. De la placa sembrada con la bacteria, seleccionar una colonia aislada y con el asa resuspenderla mediante movimiento rotatorio de la misma, en el tubo marcado cmo ADN+, hasta quedar completamente homogéneo.
6. Colocar el tubo en la gradilla.
7. Esterilizar el asa.
8. Repetir los pasos 5, 6 y 7 con el tubo ADN-.
9. Examinar el frasco que contiene al plásmido, con una lámpara de luz ultra violeta.
10. Tomar una asada y mezclarlo  en el tubo marcado como ADN+.
11. Tapar el tubo y regresarlo a la gradilla  que esta en el hielo.
12. NO AGREGAR PLASMIDO AL TUBO MARCADO COMO ADN-.
13.  Incubar los tubos en hielo por 10 minutos .Asegurarse que estén sumergidos en el hielo.
14. Mientras se incuban los tubos marcar los medios proporcionados como se indica:

       Una placa de LB/amp como ADN+
       Una placa de LB/amp/ara como ADN+
       Una placa de LB/amp como ADN-
       Una placa de LB como ADN-

   15. Choque térmico. Transferir la gradilla con los tubos de hielo a un baño a 42°C por exactamente 50 segundos.
   16. Asegurarse que los tubos estén sumergidos en el agua caliente.
   17. Rápidamente regresar la gradilla con los tubos al hielo, incubar por 2 minutos.  
   18. Sacar la gradilla del hielo y colocarla en su mesa de trabajo.
   19. Con pipetas estériles diferentes, agregar 250 µL de caldo LB a cada tubo (ADN+ y ADN-).
   20. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
   21. Mezclar los tubos por inversión.
   22. Con pipeta estéril nueva, tomar 100 µL de la suspensión transformada (ADN+) y colocarlos en la caja marcada como LB/amp ADN+ y otros 100 µL en la caja LB/amp/ara ADN+.
   23. Con otra pipeta estéril, inocular con 100 µL de la suspensión control (ADN-), las cajas marcadas como LB/amp ADN- y LB ADN-. 
   24. Con un  asa estéril, distribuir  masivamente el inoculo en la superficie de las cajas.
   25. Incubar los medios a 37 ^oC por 24 horas.
   26. Observar resultados y hacer las anotaciones correspondientes.

VI.- SUGERENCIAS DIDÁCTICAS  

1. Fomentar el uso de tecnologías de la información.
2. Vincular los conocimientos teóricos con su aplicación práctica.
3. Fomentar la investigación científica y creatividad, en la aplicación de esta técnica de laboratorio, brindando ejemplos recientes. 

VII .- REPORTE:
  1. Completar la siguiente tabla con sus resultados.

2.   Hacer una discusión de sus resultados.

3.    Concluir  en base a sus resultados.

CUESTIONARIO

1.    Mencione cuales características transfiere el plásmido pGLO a las bacterias transformadas.

2.    Explique cual es la importancia de realizar un choque térmico a la bacteria.

3.    Diga para que sirve la caja marcada como LB ADN-.

4.    Explique que función tiene la ampicilina en el medio de cultivo.

5.    Explique que función tiene la arabinosa adicionada al medio de cultivo.

6.    Mencione 2 ejemplos de microorganismos transformados y su aplicación.

VIII.- BIBLIOGRAFÍA 

1.    Madigan, M. T., J.M. Martinko  y J. Parker.2003. Brock: Biología de los microorganismos. Madrid, España 10ma. Ed.  Editorial Pearson Prentice-Hall.

2.    Mardigian. R. Biotechnology Explorer pGLO^TM  Bacterial Transformation Kit.