4. Cultivo Puro y Aislamiento de Bacterias Aerobias

PRÁCTICA No. 4
CULTIVO PURO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS

I.- OBJETIVO. Aplicar algunos de los métodos que existen para aislar bacterias aerobias y  obtener cultivos puros.

II.- INTRODUCCIÓN. Existen diversos procedimientos y tipos de equipo que se emplean en el laboratorio de microbiología para el aislamiento e identificación de microorganismos. El primer paso es la obtención de cultivos puros.

     Un cultivo puro es aquel que se desarrolla a partir de una célula única y por lo tanto esta formado por un solo tipo de microorganismo, lo que nos permite conocer sus características morfológicas, de tinción, actividades fisiológicas, patogenicidad, etc.

Los métodos para el trabajo con microorganismos se han diseñado para conservar la pureza de los cultivos y evitar su contaminación con otros microorganismos que no nos interesan. Para lograr esto se utiliza diversas técnicas que nos permiten obtenerlos en forma pura y aislada a partir de muestras con una gran diversidad microbiana (cultivos mixtos)  como pueden ser: suelo, alimentos, agua.

Estos métodos incluyen:
·         Dilución en tubo o diluciones seriadas
·         Estría cruzada en placa

     El método de dilución en tubo se basa en la disminución del número de microorganismos de una muestra inicial, mediante diluciones seriadas, y posteriormente una siembra de cada una de las mismas, utilizando el vaciado en caja o la dispersión con varilla acodada.

     En la estría cruzada, a partir de una muestra inicial, el número de microorganismos disminuye al ser esparcidos con el asa sobre la superficie del medio de cultivo, mediante una serie de estrías. 
     
     Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas que les permiten ser utilizados de acuerdo a lo que se requiere.

III.- CORRELACIÓN CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA (ING. BIOQUÍMICA BQO-0525).

Tema: Métodos y técnicas microbiológicas básicas.

Subtema: Métodos y técnicas de aislamiento y selección.

La obtención de un cultivo puro mediante las técnicas  y medios de cultivo adecuados, es esencial para poder desarrollar cualquier estudio microbiológico.


IV.- MATERIAL Y EQUIPO

• 20 cajas de petri
• 10 tubos de vidrio (16 x 15) con agua destilada estéril
• 3 pipetas de 1 mL
• 1 asa bacteriológica
• Agar nutritivo
• Agar EMB
• Incubadora
• Mechero 

V.- PROCEDIMIENTO

Dilución en tubo y vaciado en caja.

1. Tomar 1 g o 1 mL. de muestra con una pipeta de 1 o 2 ml y colocarla en un tubo con 9 ml de agua destilada estéril.
2. Hacer diluciones decimales de 10 ^-1 a 10^-10   con una pipeta de 1 mL.
3. Con otra pipeta vaciar por duplicado 1 mL de cada dilución a la caja petri, empezando con 10^-10  
4. Adicionar 12 mL del medio de cultivo fundido y enfriado a temperatura de 45 ºC en cada caja petri.
5. Homogenizar
6. Dejar solidificar y hacer un paquete con las cajas
7. Incubar a 37 ºC  por un periodo de 72 horas
8. Realizar conteo de colonias cada 24 horas y reportar. UFC/ g o mL de muestra original.

Estría cruzada

1. De la dilución 10 ^-1 tomar con el asa estéril varias asadas y colocarlas en la caja de petri según lo que indique el profesor.
2. Proceder a hacer la primera serie de estrías a partir de la muestra colocada en la caja de petri.
3. Esterilizar el asa, enfriarla y realizar una segunda serie de estrías, tocando con el asa la parte final de la primera seria de estrías.
4. Esterilizar el asa, enfriar y realizar una tercera serie de estrías, tocando con el asa la parte final de la segunda serie de estrías.
5. Realizar una cuarta serie de estrías como se indicó anteriormente
6. A partir de la última serie de estrías, con el asa estéril y enfriada hacer una estría amplia abarcando el centro de la caja petri. Tener cuidado de que esta estría no toque la primera serie de estrías.
7. Marcar el material indicando: nombre, grupo, fecha, dilución, etc.
8. Incubar el material de 24 a 48 horas a 37 ºC.

      9.  Resembrar tres colonias que estén perfectamente aisladas en  tubos con medio inclinado, para
           obtener un cultivo puro.
     10. Guardar las cajas de donde se seleccionaron las colonias para la siguiente sesión.

VI.- SUGERENCIAS DIDACTICAS
 

1. Vincular los conocimientos teóricos con el trabajo en el laboratorio.
2. Generar la reflexión crítica, mediante la discusión de sus resultados al aplicar los diferentes métodos para aislar y obtener cultivos puros de bacterias aerobias.

VII.- REPORTE 

      1.    En una tabla colocar el UFC/ g o mL de muestra  contando las cajas que tengan entre 25 y      250 colonias y multiplicando por la inversa de la dilución.
2.    Determinar el UFC/g o mL final tomando en cuenta las diluciones adecuadas.
3.    Hacer una conclusión sobre sus resultados y las técnicas empleadas. 

Cuestionario

      1.    Explicar por que para determinar el UFC/g o mL de muestra se multiplica por la inversa de      la dilución.
2.    Explique por que sólo deben contarse las cajas que tengan entre 25 y 250 colonias.
3.    Mencione algunos errores y como pueden alterar sus resultados en estas técnicas. 

VIII.- BIBLIOGRAFÍA

1.- Madigan, M. T., J.M. Martinko y J. Parker.2003. Brock Biología de los microorganismos. Madrid, España. 10^a  edición. Editorial Pearson-Prentice-Hall.

2.-Pelczar M. 1984. Microbiología. Editorial McGraw Hill.